2013年自考《微生物遗传学》第八章考点

2013年08月05日来源：网络字体：大小打印

　　第八章工业微生物杂交育种

　　第一节杂交育种原理

　　一、基因重组：将两个不同形状个体内的基因转移到一起，经过重新组合，形成新的遗传型个体的过程称为基因重组。

　　二、杂交育种微生物传递的途径

　　1、通过双亲细胞的融合，涉及到整套染色体的基因重组，如真核微生物的有性生殖、准性生殖。（酵母菌杂交、霉菌的杂交）

　　2、通过双亲细胞的沟通，涉及到部分染色体的基因重组，如原核微生物的接合，（F因子传导）

　　3、双亲细胞不接触，仅个别少数基因的重组，如原核微生物的转导、转化。（噬菌体感染）

　　三、杂交育种

　　一个菌种长时间使用诱变剂处理后，其生活能力逐渐下降，如生长周期延长、孢子减少、代谢减慢、产量增加缓慢等。故杂交育种就成为菌种选育的另一重要手段，杂交是细胞水平的概念，而基因重组是分子水平的概念。

　　已知供体、受体亲本。杂交育种更具在方向性，但方法复杂、进度慢，筛选工作大，应用不广。

　　四、杂交育种的目的

　　1、改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种；

　　2、克服因长期诱变造成的生活力下降、代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应。

　　3、使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂交株。

　　4、分析杂交结果，可以总结遗传物质的住那一和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。

　　五、微生物杂交育种基本程序

　　选择原始亲本→ 诱变筛选直接亲本→直接亲本之间亲和力鉴定→杂交→分离到基本培养基或选择性培养基培养→筛选重组体→重组体分析鉴定。

　　六、杂交育种使用的材料

　　1、出发菌株 2、培养基 3、器皿 4、直接亲本（标记菌）

　　第二节原核微生物的杂交育种

　　一、细菌杂交育种（重点）

　　（一）接合是指两个性别不同的微生物细胞之间接触，遗传物质转移、交换、重组，形成一个新个体。（指通过供体菌和受体菌的完整细胞的直接接触，传递大片的DNA（包括质粒）遗传信息的的现象。

　　（二）致育因子

　　细菌的杂交关键是性因子，即F因子。F因子是一种质粒，它存在于细菌的细胞质中，一般为游离状态，有时和染色体以结合态存在，是一种稳定的遗传物质。

　　1、F+菌株：具备F性因子的细胞称为有性因子菌株（F+），即“雄性”菌株，为供体菌。其F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。又称为低频重组菌种。

　　2、F-菌株：不具备F性因子的细胞称为无性因子菌株（F-），即“雌性”菌株，为受体菌。无有性菌毛，可通过接合作用接收F因子变成F+.

　　3、Hfr菌株：有时供体菌的F因子可以整合到细胞染色体DNA上，这样使F+菌株成为高度致育细胞，称为Hfr菌株，这类菌株的特点是不仅细胞内很有F因子，而且F因子的DNA嵌入染色体的DNA中。转移染色体基因的能力很高，重组频率大，又称高频重组菌株。其细菌表面有性菌毛。

　　4、F‘菌株：Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子称为F’因子。含有这种性因子的菌株就称为F‘菌株，又称低频重组菌株。

　　F因子转导：当F‘细胞与F-细胞接合时，把所携带的供体菌部分染色体基因也同时转移到F-细胞中去，使受体菌株遗传性状发生改变而获得重组体，这个过程称为F因子转导。

　　（三）杂交过程详见书P259

　　1、F-*F+杂交——重组频率低

　　（1）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；

　　（2）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中；

　　（3）F因子的一条链进入F-细菌中，在F-细菌中复制新的F因子；

　　（4）复制完成后，F-细菌变成了F+细菌，同时原有F+细菌也完成了F因子的复制。

　　2、Hfr*F-杂交——杂交更好组合

　　杂交过程：当Hfr菌株与F-菌株接触，细胞壁沟通，Hfr细胞染色体单链打开，远离F因子一端的染色体DNA先进入F-细胞内，F因子到更后才转入或不转入到F-菌株中，待进入F-菌株细胞的一段供体染色体和受体染色体结合形成部分合子，经过双交换或两次单交换，Hfr菌株的一段染色体整合到F-菌株细胞的环状染色体中，形成具有一定新遗传性状的重组体菌株。

　　中断杂交实验——如果在两个配对菌株拉倒过程中，每隔一定时间以强烈搅拌中断接合，结果导致Hfr菌株转移到F-菌株中染色体节段的断裂位置不一，由此造成进入受体细胞具在Hfr性状的基因数量和种类不同，从而可获得多样化类型的重组体，称为中断杂交实验。

　　（四）细菌杂交方法与技术P262

　　1、杂交亲本菌株，根据实验选择不同遗传特性的两亲本菌株，并且要还一定选择性标记和非选择性标记。

　　2、标记菌株，更常用的标记为营养缺陷。

　　3、性别菌株的获得：F+菌株，F+菌株与F-菌株接合并把F因子转移到F-菌株中，从而使F-菌株转变为F+菌株；F-菌株，把F+菌株用不足以抑制其生长的低浓度吖啶橙处理即可得F-菌株；Hfr菌株，通过F+菌株和F-菌株杂交获得。

　　4、杂交方法，细菌杂交一般采用直接混合法（详见P262）：将两个直接亲本菌株分别培养至对数期，再将Hrf菌株和F-菌株细胞以1：10或1：20的比例混合，水浴振荡，菌株细胞接合，亲本菌株间的染色体进行连接、交换和重组，然后稀释涂布在基本培养基上或其他选择性培养基上筛选得到各种重级菌株或其他杂交后代。

　　二、放线菌的杂交育种（重点）

　　（一）放线菌杂交原理：通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，更终达到基因重组。杂交原理相似于细菌，杂交方法相似于霉菌。放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。P265

　　1、异核现象：有些放线菌的营养缺陷型在混合培养或杂交过程中，经菌丝和菌丝间的接触和融合而形成异核体。

　　2、接合现行：菌丝间接触和融合后，相同细胞质里把不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体的转移或遗传信息的交换，接合现象导致部分合子的形成。

　　3、杂合系的形成：部分合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进行一次交换，产生杂合系。杂合系是由基质菌丝中长出来的，形成的菌落很小，能在选择性培养基和基本培养基上生长。

　　4、重组体的形成：以上检出的杂合系或重组杂合系，在以后进一步繁殖过程中，杂合状态染色体的不同区段还要进行几次交换。根据交换的位置不同，所携带的基因种类、数量也不一致，形成了一系列基因型的环状染色体细胞，从产生的菌落中可检出不同类型重组分离子。杂合系是形成重组体所必须的阶段。

　　（二）放线菌杂交过程（示意图见P266）

　　亲本→局部结合子（部分合子）→杂合系→重组体

　　1、部分结合子是由一个供体细胞的部分染色体和一个受体细胞整套染色体相结合，同时存在于一个细胞质中，也有时两个亲本细胞的染色体都是以部分染色体进行结合。两个亲本细胞以全部染色体进行结合形成的异核体在复制过程中染色体不发生交换，所产生的分生孢子进一步培养又获得两亲本。

　　2、部分合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进行一次交换，产生了杂合系。杂合系是由基质菌丝中长出的，形成的菌落很小，能在选择性培养基和基本培养基上生长。

　　3、杂合系不是封闭的环状结构而是呈线状，经过进一步繁殖，形成一系列基因型的环状染色体细胞，从而形成重组体。

　　（三）放线菌的杂交技术图示P267

　　放线菌杂交方法有混合培养法、杂核系分析法、玻璃纸法和平板杂交法等。

　　一、混合培养法：

　　（1）直接亲本是杂交配对菌株，要求携带不同的营养缺陷型或抗性作为遗传标记。

　　（2）斜面混合接种（CM），即取两亲标新培养的成熟孢子或菌丝，重迭接种到完全培养基斜面。

　　（3）单孢子的制备，即制单孢子悬液。

　　（4）重组体的检出：用选择性平板分离得到目的重组体。

　　二、杂合系分析法：图示P270

　　从混合培养的孢子悬液中，分离筛选杂合系，再进一步从杂合第中筛选各种分离子。

　　两亲本混合培养→孢子悬液→MM培养基培养→取杂合系菌落（较小的）上的孢子制成单孢子悬液→CM培养基上培养→点种→影印到多种不同的选择性培养基平板上→得到所需要的重组体

　　三、玻璃纸法：

　　两亲本都具有营养缺陷型标记，且对同一药物一个敏感，另一个具有抗性。

　　两亲本孢子混合，接种到覆盖于CM培养基的玻璃纸表面，经一定时间培养，将玻璃纸转移到含有药物的SM培养基上培养，得到惟独能生长的特定杂合系菌丛。

　　四、平板杂交法：将CM上培养的A亲本菌落孢子影印至在CM（或有限培养基）上培养的B亲本菌落平板上，培养一段时间，两亲本菌丝接合形成部分合子，染色体进行单交换后形成杂合系，然后影印其孢子到各种选择性培养基平板上，从中可检出重组体分离子。

　　注：有限培养基（LM）是由CM和MM以1：9组成。

　　三、转导（了解）

　　定义：借助温和噬菌体为媒介，把供体细胞中DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞称为转导子。转导过程不需要接触，而是以噬菌体为载体。

　　（一）普通（普遍）传导：媒介为完全缺陷噬菌体（侵染后其DNA为供体细胞的）

　　（二）局限传导：媒介为部分缺陷噬菌体（侵染后其部分DNA为供体细胞的）

　　四、转化（了解）

　　转化是受体菌直接吸收环境中供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。

　　转化因子：起转化作用的供体细胞的DNA片段；转化子：通过转化作用形成的受体细胞。

　　特点：1. 一般只发生在同一物种或近缘物种之间；2.受体细胞只有处于感受态阶段才能吸收供体的DNA.

　　感受态：指细胞能从周围环境吸收DNA分子，将其整合入自己的基因组，并保证不被体内DNA酶破坏的生理状态，即实现转化的一种生理状态。

　　转化育种条件：1、感受态的出现（a受体细胞的遗传，b生理状态，c菌龄，d培养条件）；2、供体DNA浓度（实现转化所需的DNA浓度极低）；3、DNA相对分子质量（一般为10*-7，约含有50个基因，太短则不能转化）；4、感受态因子（它是一种胞外蛋白）。

　　第三节真核微生物的杂交育种

　　一、有性杂交：不同遗传型微生物的性细胞（单细胞）发生接合和重组的现象。

　　准性杂交：不同遗传型微生物体细胞的核融合而导致的一种低频率基因重组现象（亲缘关系很近的亲本）。

　　二、霉菌的杂交育种P277

　　（一）霉菌的准性生殖

　　两亲本→准性接合→基因重组→新遗传型→菌丝联结→质配→核配→有丝分裂→单倍子

　　准性生殖和有性生殖的区别；准性生殖有性生殖

　　参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态、生理上存在分化的性细胞

　　独立生活的异核阶段有无

　　接合后双倍体细胞形态与单倍体相同与单倍体不同

　　双倍体变成单倍体的途径有丝分裂减数分裂

　　频率偶然、低正常出现、高

　　（二）准性生殖的三个阶段：

　　在菌丝体生长过程中，不同遗传类型的菌丝细胞接触融合，形成异核体、杂交二倍体，更后经染色体相互交换，产生一个具有新遗传特性的菌株。

　　异核体的形成（不稳定）→杂合双倍体的形成（稳定）→体细胞交换和单元化（单倍体化）

　　异核体：具有不同性状的两菌株的菌丝互相连接，导致在一个细胞或一条菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的细胞核，进行质配，两个不同基因型的核独立存在，这样的菌丝体称为异核体。（可参照P279的定义）。异核体属于不稳定菌株，它们所产生的分生孢子会分离成两种亲本型，不能在MM上生长。

　　杂合双倍体的形成：异核细胞不够稳定，异核体中不同基因型的两个核有少数可发生细胞融合，进行核配，形成二倍体核，其存在较稳定。采用天然樟脑蒸气熏蒸或紫外线照射异核体，可以诱发异核体形成杂合二倍体。体细胞交换：是指杂合二倍体核在有丝分裂过程中的交换现象，染色体之间发生交换而产生部分标记。（频率0.001）单倍化：指杂合二倍体细胞在增殖过程中，基因借助整条染色体的随机交换而得到单倍重组体或单倍的亲本分离子。（频率0.01）

　　（三）霉菌杂交技术

　　（1）选择亲本；（2）强制异合；（3）移单菌落；（4）稳定性检验（杂合二倍体稳定，而异核体不稳定）；（5）促进变异（紫外线处理……）。

　　说明：杂合二倍体常常在异核体菌落上以角变或斑点形态出现，用接种针挑取其分生孢子，则可分离、纯化得到杂合二倍体。（移单菌落）

　　三、酵母菌的有性杂交

　　（一）有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型的一种育种技术。

　　雌雄菌株→有性接合→染色体重组→新遗传型

　　（二）酵母有性杂交育种的基本过程

　　1、亲株的选择：具有亲合性和遗传标记，考虑育种的目的性；

　　2、形成子囊孢子（用产孢培养基）

　　3、接合：酶法或机械法破碎子囊，释放孢子，再平板涂布培养得到单倍体细胞，然后将两个亲本的单倍体细胞密集在一起，就可能的发生接合获得各种类型杂合子

　　4、杂交二倍体的筛选，从不同的杂合子中筛选初优良性状的个体。

　　酵母的双倍体与单倍体差异大